{"id":256,"date":"2020-04-29T10:39:11","date_gmt":"2020-04-29T08:39:11","guid":{"rendered":"https:\/\/artemisiavet.de\/?page_id=256"},"modified":"2020-09-03T14:48:55","modified_gmt":"2020-09-03T12:48:55","slug":"retrospektive-untersuchung-von-kleinen-tumoren-bei-haustieren","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/artemisiavet.de\/index.php\/results\/publications\/uebersetzungen\/retrospektive-untersuchung-von-kleinen-tumoren-bei-haustieren\/","title":{"rendered":"Retrospektive Untersuchung von Tumoren bei kleinen Haustieren"},"content":{"rendered":"
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY DOI: 10.3892\/ijo.2019.4921<\/div>\n
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Originaldatei<\/a><\/div>\n<\/div>\n
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Retrospektive Untersuchung von Tumoren kleiner Haustiere, die mit Artemisia annua und Eisen behandelt wurden<\/span><\/h3>\n

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MOHAMED E.M. SAEED 1*, ELMAR BREUER 2*, MOHAMED\u2011ELAMIR F. HEGAZY 1 und THOMAS EFFERTH 1
\n1 Department of Pharmaceutical Biology, Institute of Pharmacy and Biochemistry, Johannes Gutenberg University, Mainz, D\u201155128 Rhineland\u2011Palatinate;
\n2 Veterinary Clinic for Small Animals, \u2018Alte Ziegelei\u2019 M\u00fcllheim, D\u201179379 Baden, Germany<\/span><\/p>\n

Eingegangen am 26. Februar 2019; Akzeptiert am 7. Oktober 2019<\/span><\/p>\n

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Abstrakt.<\/strong>
\nArtemisinin aus Artemisia annua L.<\/em> und seine Derivate sind bekannte Malariamedikamente. Dar\u00fcber hinaus haben In-vitro-<\/em>Studien, In-vivo-<\/em>Studien und klinische Studien gezeigt, dass diese Arzneimittel bei menschlichen Krebspatienten eine Antikrebsaktivit\u00e4t aufweisen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher zu untersuchen, ob ein phytotherapeutisches A. annua<\/em>-Pr\u00e4parat bei Tumoren kleiner Haustiere eine Antikrebsaktivit\u00e4t aus\u00fcbt. Hunde und Katzen mit spontanem Krebs (n = 20) wurden mit einer Standardtherapie plus einem kommerziellen A. annua<\/em>-Pr\u00e4parat (LupArte\u00ae<\/sup>) behandelt und mit einer Kontrollgruppe verglichen, die nur mit einer Standardtherapie behandelt wurde (n = 11). Immunhistochemische Analysen wurden mit formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorbiopsien durchgef\u00fchrt, um die Expression des Transferrinrezeptors (TfR) und des Proliferationsmarkers Ki-67 als m\u00f6gliche Biomarker zur Beurteilung des Behandlungsansprechens von Tumoren auf A. annua zu analysieren. Schlie\u00dflich wurden die Expressionsniveaus von TfR und Ki-67 mit den IC50<\/sub>-Werten gegen\u00fcber Artemisinin in zwei Hundetumorzelllinien (DH82 und DGBM) und einer Gruppe von 54 menschlichen Tumorzelllinien verglichen. Retrospektiv bewertete die vorliegende Studie die \u00dcberlebenszeiten von Kleintieren, die mit Standardtherapie mit oder ohne A. annua<\/em> behandelt wurden. Die A. annua<\/em>-Behandlung war mit einer signifikant h\u00f6heren Anzahl von Tieren verbunden, die > 18 Monate \u00fcberlebten, verglichen mit Tieren ohne A. annua<\/em>-Behandlung (P = 0,0331). Unter Verwendung eines zweiten Satzes kleiner Haustiertumoren wurde durch Immunhistochemie eine signifikante Korrelation zwischen TfR- und Ki-67-Expression identifiziert (P = 0,025). Um die Assoziation der Transferrin- und Ki-67-Expression mit der zellul\u00e4ren Reaktion auf Artemisinin weiter zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Studie die Expression dieser beiden Biomarker und die IC50<\/sub>-Werte f\u00fcr Artemisinin in Tumorzelllinien des National Cancer Institute in vitro verglichen. Beide Marker waren umgekehrt mit der Artemisinin-Reaktion assoziiert (P <0,05), und die Expressionsniveaus von TfR und Ki-67 waren signifikant korreliert (P = 0,008). Zusammenfassend l\u00e4sst sich sagen, dass die vielversprechenden Ergebnisse der vorliegenden retrospektiven Studie eine weitere Best\u00e4tigung durch prospektive Studien in der Zukunft rechtfertigen.<\/span><\/p>\n

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Einleitung<\/strong>
\nLabortiere sind f\u00fcr die biomedizinische Forschung unverzichtbar. Sie werden verwendet, um Krankheitsmodelle zu entwickeln, um die Pathogenese menschlicher Krankheiten besser zu verstehen und um neue Behandlungsoptionen zu entwickeln. In der Krebsforschung werden seit Jahrzehnten transplantierte syngene, xenotransplantierte und orthotope Tumormodelle oder chemisch induzierte Tumoren bei M\u00e4usen oder Ratten verwendet (1). Trotz dieser weit verbreiteten Tierversuchsmodelle wurde in der menschlichen Onkologie \u00fcbersehen, dass Tiere in vergleichbarer Weise wie menschliche Patienten an spontan auftretenden Tumoren leiden k\u00f6nnen. Diese Tiertumore sind im Vergleich zu experimentellen Tumormodellen sehr eng mit der Situation beim Menschen verbunden, da sie spontan auftreten und weder durch Transplantation aufrechterhalten noch durch chemische Karzinogene induziert werden (2). Spontane Tumore bei Tieren bieten daher eine attraktive, wenn auch untersch\u00e4tzte M\u00f6glichkeit, neuartige Behandlungsstrategien vor der klinischen Anwendung bei Krebspatienten zu untersuchen. Da die Behandlung von spontanen Tumoren bei Tieren auch in der Veterin\u00e4rmedizin von Bedeutung ist, sind Studien zu Tumoren bei Tieren auch f\u00fcr die veterin\u00e4rmedizinische Onkologie von gro\u00dfer Bedeutung. Die \u00dcberlebensprognose von b\u00f6sartigen Tumoren bei Kleintieren ist bei weitem nicht zufriedenstellend und die Mehrheit erliegt der Krankheit auch nach Anwendung chirurgischer, radioaktiver oder chemotherapeutischer Eingriffe (3,4). Die klinische Prognose sowie klinische, pathologische und biochemische Faktoren, die das \u00dcberleben von Haustieren beeinflussen, wurden f\u00fcr Hunde (5-9, 13), Katzen (10-12)<\/span> und andere Arten (14,15) angegeben. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Behandlung von veterin\u00e4rmedizinischen und menschlichen Tumoren bleibt die Situation schlecht und zahlreiche Patienten erliegen ihrer Krankheit. Daher sind neuartige Behandlungsm\u00f6glichkeiten dringend erforderlich.
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Die Mehrzahl der klinisch etablierten Arzneimittel stammt aus Naturstoffen (16). Daher scheint die Suche nach neuartigen Behandlungen bei Verwendung nat\u00fcrlicher Quellen am vielversprechendsten zu sein. Ein aktuelles Beispiel f\u00fcr die G\u00fcltigkeit dieses Konzepts ist <\/span>Artemisinin. Artemisinin ist ein bioaktives Terpenoid, das aus Artemisia annua L. isoliert wurde, einem Heilkraut, das seit etwa zwei Jahrtausenden in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet wird (17). Die Isolierung von Artemisinin aus A. f\u00fchrte zu einer neuartigen Behandlungsoption von herausragender Bedeutung f\u00fcr Malaria. Artemisinin und seine Derivate sind f\u00fcr das \u00dcberleben von Millionen von Malariapatienten verantwortlich (18, 19). Diese Leistung wurde 2015 mit der Verleihung des Nobelpreises f\u00fcr Medizin oder Physiologie an den chinesischen Wissenschaftler Youyou Tu (20) gew\u00fcrdigt. W\u00e4hrend Artemisinin-Derivate wie Artemether und Artesunat als Malariamedikamente gut etabliert sind, hemmen pflanzliche Pr\u00e4parate von A. annua auch Plasmodia-Infektionen bei Patienten mit Malaria (21). Insbesondere ist die Bioaktivit\u00e4t von Artemisinin nicht auf Malaria beschr\u00e4nkt, und andere Krankheiten sind auch anf\u00e4llig f\u00fcr die Behandlung mit Artemisinin und A. annua, wie Bilharziose und Trypan-Somiasis (22-24), verschiedene Virusinfektionen (25) und Krankheiten im Zusammenhang mit metabolischen Syndromen, einschlie\u00dflich Fettleibigkeit, Diabetes und Atherosklerose (26-28).
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Artemisinin-Derivate hemmen auch das Wachstum menschlicher Tumorzellen in vitro und in vivo (29-31). Dies ist nicht nur f\u00fcr die Krebstherapie relevant, sondern auch f\u00fcr die Krebspr\u00e4vention (32, 33). Artemisinin-Derivate \u00fcben additive oder synergistische Wechselwirkungen in Kombination mit einer Vielzahl klinisch etablierter Arzneimittel aus (34-36). Dies wurde auch in veterin\u00e4rmedizinischen Tumorzelllinien in vitro und in veterin\u00e4rmedizinischen klinischen Studien nachgewiesen (37-39). Basierend auf der Antikrebsaktivit\u00e4t in experimentellen Tumormodellen war es m\u00f6glich, die Antikrebsaktivit\u00e4t bei H\u00e4rtef\u00e4llen menschlicher Krebspatienten zu untersuchen (40, 41) und sogar klinische Phase I\/II Studien bei menschlichen Krebspatienten durchzuf\u00fchren (42) \u201144). Eine andere fr\u00fchere klinische Phase I\/II Studie zeigte die Antikrebsaktivit\u00e4t bei einer Reihe von Hunden mit Tumoren (39). Vorl\u00e4ufige Ergebnisse bei drei Hunden und einer Katze zeigten, dass ein Kr\u00e4uterpr\u00e4parat von A. annua (LupArte\u00ae<\/sup>) m\u00f6glicherweise die \u00dcberlebenszeit von Tieren mit Tumoren verl\u00e4ngert (45). Um diese vorl\u00e4ufigen Ergebnisse von A. annua bei H\u00e4rtef\u00e4llen zu untermauern, hat die vorliegende Studie eine retrospektive Analyse durchgef\u00fchrt, indem die \u00dcberlebenszeiten von 25 mit A. annua behandelten Haustieren im Vergleich zu 11 Tieren ohne A. annua-Behandlung bewertet wurden. Unabh\u00e4ngig von der Nahrungserg\u00e4nzung mit A. annua wurden alle Tiere Standardbehandlungsprotokollen unterzogen. Zus\u00e4tzlich wurde die Expression von zwei Biomarkern, dem Transferrinrezeptor (TfR) und dem Proliferationsmarker Ki-67, durch immunhistochemische Analyse von Tumorbiopsien bestimmt.<\/span><\/p>\n

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Materialien und Methoden<\/strong>
\nArtemisininbestimmung in A. annua.<\/strong> Kernspinresonanzspektren (NMR) wurden mit einem Bruker 300-NMR-Spektrometer (Bruker Corporation) aufgenommen. Umkehrphasen-Hochleistungsfl\u00fcssigkeitschromatographie-<\/span>(HPLC-)Massenspektrometrie (MS)-Analyse wurde an einer Waters Alliance 2695 LC (Waters Corporation) durchgef\u00fchrt, die an eine Quattro Ultima-Dreifach-Quadrupol-MS (Waters Corporation) gekoppelt war, und zwar unter Verwendung der gleichen Trennbedingungen wie zuvor beschrieben
\n<\/span>( 46). Die Trennbedingungen waren wie folgt: Chromatogramms\u00e4ule, XBridge\u2122-S\u00e4ule (4,6 \u00d7 150 mm, 5 \u00b5<\/span><\/span>m); S\u00e4ulentemperatur 20 \u00b0 C; und Injektionsvolumen 1 \u00b5<\/span><\/span>l. <\/span>Die Elution wurde mit einer Flie\u00dfgeschwindigkeit von 1 ml \/ min durchgef\u00fchrt, wobei als mobile Phase ein Gemisch aus Wasser (A) und Acetonitril (B) verwendet wurde. Die Proben wurden unter Verwendung des folgenden Gradienten eluiert: 0 min, 98,0% A; 0\u20138 min, linearer Anstieg auf 100% B; 100% A f\u00fcr 2 min, 11-12 min gehalten, R\u00fcckkehr auf 98,0% A. Die endg\u00fcltige Optimierung der Betriebsparameter der ESI-Quelle war ein Stickstoffgasstrom von 11 l \/ min, ein Zerst\u00e4uber von 30 psi, eine Kapillarspannung von \u00b1 2,4 kV und eine Trocknungsgastemperatur von 250 \u00b0 C (N2). Die Quattro Ultima Triple Quadrupol MS arbeitete im Mehrfachreaktions\u00fcberwachungsmodus mit einer Aufl\u00f6sung von 0,7 m \/ z. Elektrospray-Ionisation (positiver Modus) und Photodiodenarray-Detektion bei 254 nm wurden durchgef\u00fchrt. Verschiedene Chargen von A. annua<\/em> (LupArte\u00ae<\/sup>) wurden vom Institut f\u00fcr Pharmazeutische Biologie der Universit\u00e4t Johannes Gutenberg (Mainz, Deutschland) bestimmt. Dieser verblindete Ansatz wurde als Qualit\u00e4tsma\u00df verwendet, um das Vorhandensein von Artemisinin in LupArte\u00ae<\/sup> unabh\u00e4ngig zu gew\u00e4hrleisten. Jede Charge von A. annua-<\/em>Pulver (2 \u00d7 10 g) wurde mit zwei L\u00f6sungsmitteln unterschiedlicher Polarit\u00e4t, Methylenchlorid und Methanol, 24 h bei Raumtemperatur extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum eingeengt, wobei ein R\u00fcckstand von 0,8 und 1,2 g f\u00fcr Methylenchlorid bzw. Methanol erhalten wurde. Jeder Extrakt wurde in ein kleines Fl\u00e4schchen \u00fcberf\u00fchrt und bei Raumtemperatur trocken gehalten. Es bildeten sich kleine Kristalle, die gesammelt und mit n<\/em>-Hexan und Methylenchlorid gewaschen wurden, um Extraktreste zu entfernen. Dann wurden 1<\/sup>H- und 13<\/sup>C-NMR-Analysen durchgef\u00fchrt.<\/span><\/p>\n

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Tumore<\/strong>
\nDie Tiere wurden zwischen 2010 und 2017 behandelt. Kurz gesagt wurden 16 Hunde (10 R\u00fcden und 6 Weibchen) und 4 Katzen (2 weiblich, 1 m\u00e4nnlich und 1 N \/ A) mit A. annua<\/em> behandelt. Das Durchschnittsalter der Hunde betrug 10,31 Jahre und das Durchschnittsalter der Katzen 12,25 Jahre. Das Durchschnittsgewicht der Hunde betrug 30,125 kg und das Durchschnittsgewicht der Katzen 5,10 kg. Von allen Tieren wurden Gewebeproben entnommen und zun\u00e4chst 48 h bei Raumtemperatur (~ 22 \u00b0 C) in 4%-iger Formaldehydl\u00f6sung fixiert. Nach der Fixierung wurden die Organe zugeschnitten, verarbeitet und bei etwa 60 \u00b0 C in Paraffinwachs eingebettet. Die Schnitte wurden auf eine Dicke von 4 \u00b5<\/span><\/span>m geschnitten und routinem\u00e4\u00dfig bei Raumtemperatur mit H\u00e4matoxylin und Eosin gef\u00e4rbt. Die histopathologische Untersuchung der mit H\u00e4matoxylin und Eosin gef\u00e4rbten Schnitte wurde unter einem Lichtmikroskop in Immersions\u00f6l mit einem Zeiss Axioskop durchgef\u00fchrt. Nach routinem\u00e4\u00dfiger pathologischer Diagnose wurden die Paraffinbl\u00f6cke als \u00fcbersch\u00fcssiges Material f\u00fcr nachfolgende immunhistochemische Untersuchungen verwendet. Dar\u00fcber hinaus wurden die mit histologischem H\u00e4matoxylin und Eosin gef\u00e4rbten Tumorschnitte auf das Vorhandensein von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs) untersucht. Die klinischen Daten sind in den Tabellen I und II dargestellt. Die Besitzer der Tiere gaben eine schriftliche Einverst\u00e4ndniserkl\u00e4rung f\u00fcr diese retrospektive Studie ab. Die unterschriebenen schriftlichen Einverst\u00e4ndniserkl\u00e4rungen sind am Institut f\u00fcr Pharmazeutische Biologie der Johannes Gutenberg-Universit\u00e4t (Mainz) hinterlegt und k\u00f6nnen auf Anfrage eingesehen werden.<\/span><\/p>\n

Behandlungsprotokoll<\/strong>
\nDer Serumeisengehalt wurde nach Entnahme von Blutproben bestimmt; Ein normaler Bereich liegt zwischen 140 und 170 \u03bcg \/ dl (47). Nach anf\u00e4nglicher Bestimmung des Eisengehalts unter Verwendung des Ferrozin-Farbtests (48) wurden die Tumore nach visueller Inspektion und gegebenenfalls nach Lungenradiographie nach einem Standardprotokoll chirurgisch mit Sicherheitsr\u00e4ndern entfernt. Zwischen der Blutentnahme und der Bestimmung des Serumeisens aus dem klinischen Diagnoselabor wurde Eisen oral verabreicht [Ferrosanol\u00ae<\/sup><\/span>-Kapseln (100 mg \/ Kapsel oder 40 mg \/ Kapsel)]. Die Dosierung betrug 100 mg \/ 30 kg K\u00f6rpergewicht zweimal t\u00e4glich, gemischt mit pflanzenarmen Lebensmitteln, um eisenbindende Pflanzenmolek\u00fcle wie Phytan, Oxalate und \/ oder Phosphate zu vermeiden. Alternativ wurde Eisen subkutan (Myofer\u00ae<\/sup> \/ Ursoferran\u00ae<\/sup>; 100 mg \/ ml) in einer Dosis von 100 mg \/ 10 kg K\u00f6rpergewicht t\u00e4glich injiziert, bis die Serum-Eisen-Ergebnisse vom klinischen Labor zur\u00fcckerhalten wurden. Die Eisensubstitution wurde einzeln fortgesetzt, bis ein Eisengehalt von 250 \u00b1 30 & \u03bcg \/ dl (~ 43 \u00b1 5 \u03bcmol \/ l) im Blutserum stabil erreicht war. Ab dem vierten Tag der anf\u00e4nglichen Eisensubstitution wurden die Tiere oral mit LupArte\u00ae<\/sup>-Kapseln in einer Dosierung von 1.400 mg \/ m2<\/sup> K\u00f6rperoberfl\u00e4che behandelt, aufgeteilt auf drei Gaben pro Tag (Tabelle III). Die Kapseln wurden 1 bis 2 Stunden vor der n\u00e4chsten Mahlzeit verabreicht. Der Serumeisengehalt wurde regelm\u00e4\u00dfig \u00fcberwacht und erforderlichenfalls an 250 \u00b1 30 \u03bcg \/ dl angepasst. Die Behandlungsdetails und die Follow-up-Informationen, einschlie\u00dflich der \u00dcberlebenszeiten, wurden in den Akten der klinischen Dokumentation aufgezeichnet. Alle ethischen Fragen wurden vor der Auswertung klinischer und experimenteller Daten mit dem Regierungspr\u00e4sidium Freiburg (Deutschland) er\u00f6rtert. Nach dem Entwurf dieser retrospektiven Studie erteilte das Regierungspr\u00e4sidium Freiburg eine schriftliche Genehmigung f\u00fcr die vorliegende Studie (Az. 35-9185.81 \/ 1 vom 4. Februar 2019).<\/span><\/p>\n

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Zelllinien<\/strong>
\nDie D-GBM-Zelllinie wurde von Dr. George Stoica (Abteilung f\u00fcr Veterin\u00e4rpathobiologie, Texas A & M University, College Station, TX, USA) aus einem Hirntumor eines 8 Jahre alten m\u00e4nnlichen Boxerhundes (49) erzeugt. Die in der vorliegenden Studie verwendeten D-GBM-Zellen wurden von Dr. Pablo Steinberg (Institut f\u00fcr Lebensmitteltoxikologie und Analytische Chemie, Veterin\u00e4rmedizinische Universit\u00e4t Hannover, Hannover, Deutschland) erhalten, der sie von Dr. G. Stoica erhielt. Die histiozytische DH82-Zelllinie wurde von Dr. ML Wellman (Abteilung f\u00fcr Veterin\u00e4rpathobiologie, College f\u00fcr Veterin\u00e4rmedizin, Ohio State University, CO, USA) generiert (50). Die in der vorliegenden Studie verwendete DH82-Zelllinie wurde auch von Dr. Pablo Steinberg erhalten, der sie von der European Tissue Culture Collection (Katalog Nr. 94062922) erwarb. Ein Panel von 54 menschlichen Tumorzelllinien des Developmental Therapeutics Program (DTP) des National Cancer Institute bestand aus Zelllinien, die aus Leuk\u00e4mie, Melanom, nichtkleinzelligem Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Nierenkrebs, Eierstockkrebs, Brustkrebs und Prostatakarzinom sowie Tumoren des Zentralnervensystems stammten (51). Zuvor wurde die Zytotoxizit\u00e4t von Zellen, die 48 Stunden lang mit Artemisinin behandelt wurden, mit einem Sulforhodamin-B-Assay bewertet (52). Die log10<\/small> IC50<\/small>-Werte f\u00fcr Artemisinin- und mRNA-Expressionen f\u00fcr Ki-67 und TfR waren \u00f6ffentlich in der DTP-Datenbank (https:\/\/dtp.cancer.gov\/default.htm) verf\u00fcgbar.<\/span><\/p>\n

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Zytotoxizit\u00e4tstest.<\/strong>
\nEin Resazurin-Reduktionsassay (Promega Corporation) wurde wie zuvor beschrieben durchgef\u00fchrt (53), um die Zytotoxizit\u00e4t von Artemisinin, Artesunat und Dihydro-Artemisinin gegen\u00fcber den Hundetumorzelllinien DH82 und DGBM zu bewerten. Das Konzept des Assays basiert auf der metabolischen Reduktion des nicht fluoreszierenden Farbstoffs durch lebende Zellen zu dem stark fluoreszierenden Farbstoff Resorufin (54). Die IC50<\/small>-Werte wurden aus Dosis-Wirkungs-Kurven unter Verwendung eines nichtlinearen Regressionsanalysetools in der GraphPad Prism 7-Software (GraphPad Prism, Inc.) berechnet. Alle IC50<\/small>-Werte werden als Mittelwert \u00b1 Standardabweichung ausgedr\u00fcckt. <\/span>Jeder Assay wurde dreimal unabh\u00e4ngig mit jeweils sechs Wiederholungen durchgef\u00fchrt.<\/span><\/p>\n

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Immunhistochemie<\/strong>
\nInsgesamt 17 Tumorgewebe, die verschiedene Tumortypen bei Haustieren repr\u00e4sentieren, wurden gesammelt, um die Expression von Ki-67 und TfR in Tiertumoren zu bewerten (Tabelle V). Kurz gesagt wurden Tumorgewebe von 15 Hunden (7 R\u00fcden und 8 Weibchen) und 2 Katzen (beide weiblich) erhalten. Das Durchschnittsalter der Hunde betrug 9,33 Jahre und das Durchschnittsalter der Katzen 4 Jahre. Das Durchschnittsgewicht der Hunde betrug 27,266 kg und das Durchschnittsgewicht der Katzen 4,00 kg. Alle ausgew\u00e4hlten Tiere wurden unter Tierhaltungsbedingungen gehalten. Die immunhistochemische F\u00e4rbung von Tumorgeweben wurde wie zuvor beschrieben durchgef\u00fchrt (55). Die Objekttr\u00e4ger wurden zweimal mit Xylol (98,5% Xylol jeweils 5 min bei Raumtemperatur) gewaschen, um Paraffin zu entfernen. Dann wurden die Probengewebe durch abgestufte Waschungen mit Isopropanol in Wasser rehydratisiert. Die hitzeinduzierte Epitopgewinnung wurde unter Verwendung eines Schnellkochtopfs als Heizvorrichtung durchgef\u00fchrt. Ein Ultra-Vision-Proteinblock und UltraVision-Wasserstoffperoxidblock (Katalognummern TA-060-UB bzw. TA-060-H2<\/small>O2<\/small>Q; Thermo Fisher Scientific, Inc.) wurden hinzugef\u00fcgt, um endogene Proteine \u200b\u200bbzw. endogene Peroxidaseaktivit\u00e4t zu blockieren und eine unspezifische Hintergrundf\u00e4rbung zu vermeiden. <\/span>Die Inkubation \u00fcber Nacht bei 4\u00b0C wurde nach Zugabe von monoklonalen Prim\u00e4rantik\u00f6rpern durchgef\u00fchrt. Zum Nachweis von Ki-67 wurde der SP6-Klon (Katalognummer ab16667; Abcam) in einer Verd\u00fcnnung von 1: 200 verwendet. Zur Bestimmung der TfR-Expression wurde der H68.4-Klon (Katalog Nr. 136800; Thermo Fisher Scientific, Inc.) in einer Verd\u00fcnnung von 1: 100 angewendet. Anschlie\u00dfend wurden Meerrettichperoxidase-markierte Polymere, die mit Sekund\u00e4rantik\u00f6rpern konjugiert waren, die sowohl f\u00fcr Maus- als auch f\u00fcr Kaninchen-Prim\u00e4rantik\u00f6rper spezifisch sind, bei Raumtemperatur f\u00fcr 1 h nach Protokoll des Herstellers zugegeben (Katalognummern TL-060-QPH und TL-060-QPB; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Die endg\u00fcltige F\u00e4rbereaktion wurde mit Diaminobenzidin durchgef\u00fchrt und die Objekttr\u00e4ger wurden 3 Minuten lang bei Raumtemperatur mit H\u00e4matoxylin gegengef\u00e4rbt.
\nDie Immunf\u00e4rbung von DH82- und DGBM-Zelllinien wurde ohne die Rehydratisierungs- oder Epitop-Wiedergewinnungsschritte durchgef\u00fchrt. Kurz gesagt wurden sechs Deckgl\u00e4ser in eine 6-Well-Platte gegeben, dann wurden 5 \u00d7 105<\/sup> Zellen \/ Well \u00fcber die Deckgl\u00e4ser ausges\u00e4t und \u00fcber Nacht bei 37 \u00b0 C in einer angefeuchteten 5% CO2<\/small> -Atmosph\u00e4re inkubiert, damit sich die Zellen an den Deckgl\u00e4sern festsetzen konnten. Anschlie\u00dfend wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur in 4% Paraformaldehyd fixiert und die Blockierungs- und F\u00e4rbeschritte wie f\u00fcr den Gewebeschnitt beschrieben durchgef\u00fchrt. Die Ki-67- und TfR-Antik\u00f6rper wurden jedoch mit 1: 500 bzw. 1: 1000 verd\u00fcnnt. Die immungef\u00e4rbten Objekttr\u00e4ger wurden unter Verwendung von Pannoramic Desk (3DHISTECH Ltd.) gescannt und die Menge an Ki-67- oder TfR-exprimierenden Zellen wurde mit der Pannoramic Viewer-Software Version 1.15 (3DHISTECH Ltd.) quantifiziert. <\/span><\/p>\n

Statistische Analyse. Signifikanzwerte und Korrelationskoeffizienten wurden unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten und des exakten Fisher-Tests mit dem WinSTAT-Softwareprogramm Version 2012.1 (www.winstat.com\/) berechnet. Die lineare Regression wurde unter Verwendung von Excel 2016 (Microsoft Corporation) f\u00fcr die log10<\/small> IC50<\/small>-Werte f\u00fcr Artemisinin- und mRNA-Expressionen f\u00fcr Ki-67 und TfR durchgef\u00fchrt. P <0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied angesehen.<\/span><\/p>\n

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Ergebnisse<\/strong>
\nIdentifizierung von Artemisinin. Wie in Abb. 1A dargestellt, enthielt das 1H-NMR-Spektrum eines farblosen Kristalls f\u00fcr Artemisinin typische Signale. Das Spektrum zeigte Signale f\u00fcr drei Methylgruppen: Zwei sekund\u00e4re bei \u03b4h<\/small> 1,00 (d, J = 6,5, H-14), 1,17 (d, J = 7,2, H-13) und ein terti\u00e4res Methylsignal bei \u03b4H<\/sub> 1,40 (s), H-15). Zus\u00e4tzlich wurden zwei aliphatische Methylen-Signale bei \u03b4H<\/sub> 2,12 (brddd, J = 14,9,4,2,2,6) und 2,40 (ddd, J = 14,9, 13,1,4,1) f\u00fcr H-3a bzw. H-3b beobachtet. Ein charakteristisches Downfield-Singulettsignal bei \u03b4H<\/sub> 6.01 zeigte das Vorhandensein eines sauerstoffhaltigen Protons f\u00fcr H-5 an. Wie in 1B dargestellt, zeigte das 13<\/sup>C-NMR-Spektrum 15 Hauptkohlenstoffsignale, einschlie\u00dflich signifikanter Kohlenstoffsignale, die das Vorhandensein von Artemisinin wie folgt best\u00e4tigen: \u03b4C<\/sub> 173,3 (s, C-12), 105,2 (s, C-4), 94,3 (d, C-5) und 79,5 (s, C-6) (56). Umkehrphasen-HPLC-MS wurde verwendet, um das Vorhandensein von Artemisinin quantitativ zu analysieren. Abb. 1C zeigt das nach Aufl\u00f6sung von 2 mg \/ ml MeOH-Extrakt erhaltene Chromatogramm, das darauf hinweist, dass Artemisinin 3,46% des A. annua<\/em> (LupArte\u00ae<\/sup>) -Extrakts ausmacht.
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\"\"<\/a><\/p>\n
Abbildung 1. NMR-Spektren von A. annua-Chloroformextrakt, die das Vorhandensein von Artemisinin zeigen.<\/span>(A) 1 H-NMR (300 MHz). (B) 13 C-NMR (75 MHz). (C) RP-HPLC \/ MS-Chromatogramm von A. annua (Luparte\u00ae) -Extrakt. Die obere Abbildung zeigt das MS-Profil, w\u00e4hrend die untere Abbildung die HPLC-Messungen darstellt. NMR, Kernspinresonanz; RP-HPLC \/ MS, Umkehrphasen-Hochleistungsfl\u00fcssigchromatographie-Massenspektrometrie.<\/span><\/em><\/p>\n
\"\"<\/a><\/p>\n
Abbildung 2. H\u00e4matoxylin- und Eosin-F\u00e4rbung verschiedener Haustiertumore. (A) Tubulopapill\u00e4res Brustadenokarzinom. (B) Weichteilsarkom. (C) Plattenepithelkarzinom. (D) Neuroendokrines Karzinom. Vergr\u00f6\u00dferung x40.<\/span><\/em><\/p>\n
\"\"Abbildung 3. Quantifizierung der immunhistochemischen F\u00e4rbung von Veterin\u00e4rtumoren und Korrelation mit klinischen Parametern. (A) TfR-Expression. (B) Ki-67-Ausdruck. (C) Korrelation der TfR-Expression mit der Ki-67-Expression. (D) Korrelation des Bluteisengehalts mit der \u00dcberlebenszeit. (E) \u00dcberlebenszeit von behandelten und unbehandelten Tieren (P = 0,033). Regressionsanalysen wurden mit Excel (Microsoft Corporation) durchgef\u00fchrt. TfR, Transferrinrezeptor<\/span><\/em><\/p>\n
\"\"<\/a><\/p>\n
\n
Klinische Behandlung<\/strong>
\nInsgesamt wurden 23 Hunde und 8 Katzen in die vorliegende Studie aufgenommen. Unter diesen wurden 20 zus\u00e4tzlich zu ihrer Standardtherapie (Tabelle I) mit A. annua<\/em> behandelt und 11 wurden allein einer Standardbehandlung unterzogen (Tabelle II). Die mit A. annua<\/em> behandelte Gruppe wies 10 Karzinome (bei 8 Hunden, 2 Katzen) und 10 Sarkome (bei 8 Hunden, 2 Katzen) auf. Alle Tiere wurden zwischen 2010 und 2017 behandelt (Tabelle I). In der Gruppe der Tiere ohne A. annua-Behandlung hatten 5 Tiere ein Karzinom (3 Hunde, 2 Katzen) und 6 Tiere ein Sarkom (4 Hunde, 2 Katzen) (Tabelle II). Der Eisengehalt im Blut und die \u00dcberlebenszeiten aller Haustiere wurden aufgezeichnet. Die Wirkung der Behandlung mit A. annua<\/em> auf die Gesamt\u00fcberlebenszeit wurde bewertet. Insgesamt zeigten 13 mit A. annua<\/em> behandelte Tiere und 11 nicht behandelte Tiere eine \u00dcberlebenszeit von <18 Monaten nach der Therapie. W\u00e4hrend 7 Tiere in der mit A. annu<\/em>a behandelten Gruppe eine \u00dcberlebenszeit von > 18 Monaten nach der Behandlung mit A. annua<\/em> hatten, \u00fcberlebten keine Tiere in der nicht behandelten Gruppe > 18 Monate. Dieser Unterschied in den \u00dcberlebenszeiten zwischen den Gruppen war statistisch signifikant (P = 0,033; genauer Fisher-Test; Tabelle IV). <\/span><\/p>\n

\n\"\"<\/a><\/span>\"\"<\/a>\"\"<\/a><\/p>\n
Histologie und Immunhistochemie.<\/strong> Unter Verwendung einer zweiten Sammlung von 17 Tumoren wurde die Histologie der Tumoren durch H\u00e4matoxylin- und Eosin-F\u00e4rbung von formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Tumorschnitten bestimmt. Repr\u00e4sentative Fotografien verschiedener Tumorhistologien sind in 2 dargestellt, einschlie\u00dflich eines tubulopapill\u00e4ren Brustadenokarzinoms, eines Weichteilsarkoms, eines Plattenepithelkarzinoms und eines neuroendokrinen Karzinoms. Dar\u00fcber hinaus wurden immunhistochemische Analysen durchgef\u00fchrt. Die membrangebundene Expression von TfR (CD71) und die nukleare Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 wurden bestimmt. Der Prozentsatz der gef\u00e4rbten Zellen wurde unter Verwendung eines computergest\u00fctzten Quantifizierungssystems quantifiziert. Aus jedem Tumorabschnitt wurden sechs verschiedene Bereiche ausgew\u00e4hlt, um repr\u00e4sentative Expressionswerte bereitzustellen. Der Prozentsatz der TfR-exprimierenden Zellen lag zwischen 43,5 (\u00b1 37,9%) und 99,2% (\u00b1 0,2%), w\u00e4hrend der Prozentsatz der Ki-67-positiven Zellen in einem Bereich zwischen 6,6 (\u00b1 1,8%) und 85,7% (\u00b1 4,7%) lag (Abb. 3A und B). Da die Tumorheterogenit\u00e4t eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf die Krebstherapie spielt, konzentrierte sich die vorliegende Studie auch auf heterogene und homogene F\u00e4rbungsmuster zwischen den verschiedenen Tumorbiopsien. <\/span>Bestimmte Tumoren waren bei der immunhistochemischen F\u00e4rbung sehr heterogen, w\u00e4hrend andere eine gleichm\u00e4\u00dfige F\u00e4rbung zeigten. Dies zeigt sich in den Standardabweichungen, die zwischen 0,1 (F\u00e4lle Nr. 3, 8 und 13) und 37,9% (Fall 10) f\u00fcr TfR und zwischen 1,8 (Fall 17) und 16,3% (Fall 8) f\u00fcr Ki-67 lagen.\u00a0 (Tabelle V). Anschlie\u00dfend wurde die Korrelation zwischen der Expression von TfR und Ki-67 mit dem Satz von Tumorbiopsien untersucht, was eine statistisch signifikante Korrelation ergab (P = 0,025; r = 0,469; Abb. 3C). Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen dem Eisengehalt im Blut und der \u00dcberlebenszeit der Tiere festgestellt (P = 0,386; r = \u20130,062; Abb. 3D). Bemerkenswerterweise war der Zusammenhang zwischen der \u00dcberlebenszeit und der Behandlung mit A. annua<\/em> signifikant. Haustiere, die mit Standardtherapie plus A. annua<\/em> behandelt wurden, hatten signifikant l\u00e4ngere \u00dcberlebenszeiten als Haustiere, die nur mit Standardtherapie behandelt wurden (P = 0,033; Abb. 3E). Da der direkte Zusammenhang zwischen TfR- und Ki-67-Expression und der Zytotoxizit\u00e4t von Artemisinin in diesen Tumorproben nicht bewertet werden konnte, wurde die mRNA-Expression auf TfR- und Ki-67-Microarray-Basis in 54 menschlichen Tumorzelllinien im Vergleich zu den log10 IC50-Werten analysiert, die durch den Sulforhodamin-Assay bestimmt wurden. Sowohl die TfR- als auch die Ki-67-Expression korrelierten signifikant negativ mit der Zytotoxizit\u00e4t von Artemisinin in diesen Zelllinien (P <0,05; r <-0,20), was darauf hinweist, dass eine h\u00f6here Expression dieser beiden Marker mit einer h\u00f6heren Empfindlichkeit der Zelllinien gegen\u00fcber Artemisinin verbunden war (Tabelle VI). Die Expressionsniveaus von TfR und Ki-67 waren positiv korreliert (P = 0,008; r = 0,317). <\/span>Dieses Panel aus menschlichen Tumorlinien bestand aus Zelllinien, die von acht Tumorarten abgeleitet waren (Leuk\u00e4mie, Melanom und Hirntumor sowie Karzinom von Dickdarm, Brust, Eierstock, Niere und Prostata). Die Anzahl der Zelllinien jedes Tumortyps (n = 1\u20139) war zu gering, um signifikante Korrelationen mit Ausnahme der drei folgenden Ergebnisse aufzudecken. In Lungenkrebszelllinien korrelierten die log10 IC50-Werte von Artemisinin umgekehrt mit der Ki-67-Expression (P = 0,009; r = -0,759). In Melanomzelllinien waren die Expressionsniveaus von Ki-67 und TfR signifikant korreliert (P = 0,010; r = 0,787). In Nierenkrebszelllinien waren die Expressionsniveaus von Ki-67 und TfR ebenfalls signifikant korreliert (P = 0,019; r = 0,781) (Daten nicht gezeigt). Da alle anderen Assoziationen zwischen der Artemisinin-Reaktion und der Expression von Ki-67 und TfR statistisch nicht signifikant waren, k\u00f6nnen verl\u00e4ssliche Schlussfolgerungen zur Rolle von Ki-67 und TfR nur aus dem gesamten Zelllinienpanel gezogen werden, jedoch nicht aus dem Tumortyp.
\n<\/span><\/p>\n
\n
Repr\u00e4sentative Bilder der Immunf\u00e4rbung f\u00fcr die TfR-Expression sind in Abb. 4A-D dargestellt. Eine starke TfR-Expression wurde in Biopsien von tubulopapill\u00e4rem Brustadenokarzinom, Weichteilsarkom und Plattenepithelkarzinom festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte die Negativkontrolle keine Reaktivit\u00e4t, was auf die Spezifit\u00e4t des Immunf\u00e4rbungsverfahrens hinweist. Dar\u00fcber hinaus sind in Abb. 4E-H Beispiele f\u00fcr die Ki-67-Expression bei tubulopapill\u00e4rem Brustadenokarzinom, Weichteilsarkom, Plattenepithel-karzinom und neuroendokrinen Karzinom dargestellt. Dar\u00fcber hinaus ergab die Bewertung des Vorhandenseins von TILs in mit H\u00e4matoxylin und Eosin gef\u00e4rbten Tumorgeweben, dass in allen Tumorobjekttr\u00e4gern keine TILs vorhanden waren.<\/span><\/p>\n
 <\/p>\n
\n
Zum Vergleich wurde die Ki-67- und TfR-Expression in zwei Hundezelllinien analysiert. Histiozytisches DH82-Sarkom und DGMB-Glioblastomzellen wurden f\u00fcr beide Marker immungef\u00e4rbt. In der Tat wurden Ki-67 und TfR in beiden Zelllinien \u00fcberexprimiert, wie in Abb. 5 dargestellt. Dar\u00fcber hinaus untersuchte die vorliegende Studie die Zytotoxizit\u00e4t von Artemisinin, Artesunat und Dihydroartemis-Inin gegen\u00fcber den Hundezelllinien. Wie erwartet waren Artemisinin und seine Derivate auch in diesen Tumorzelllinien aktiv. Die IC 50 -Werte f\u00fcr Artemisinin, Artesunat und Dihydroartemisinin gegen\u00fcber DH82-Zellen und DGBM-Zellen sind in 6 dargestellt. <\/span><\/p>\n
Diskussion<\/strong>
\n<\/span>Es wurde unter Tier\u00e4rzten und Heilpraktikern diskutiert, ob eine Eisenerg\u00e4nzung f\u00fcr die Aktivit\u00e4t von Artemisinin vorteilhaft ist oder nicht. Die Rolle von H\u00e4m f\u00fcr die Antimalariaaktivit\u00e4t von Artemisinin und seinen Derivaten wurde diskutiert (57, 58). Im Zusammenhang mit Krebs haben wir zuvor berichtet, dass Ferrosanol\u00ae<\/sup> und Holotransferrin die Artesunat-induzierte Zytotoxizit\u00e4t und Apoptose bei Leuk\u00e4mie- und Astrozytomzellen um das 10-fache erh\u00f6hen. Diese Effekte wurden durch den monoklonalen Anti-TfR-Antik\u00f6rper RVS10 umgekehrt, der mit Transferrin um die Bindung an TfR konkurriert. W\u00e4hrend die TfR-Expression in Tumorzelllinien zwischen 48 und 95% lag, zeigten normale periphere mononukle\u00e4re Blutleukozyten eine TfR-Positivit\u00e4t von \u2264 1,3%, was darauf hinweist, dass Artesunat aufgrund der bevorzugten TfR-Expression in Tumorzellen zumindest teilweise tumorspezifische Wirkungen aus\u00fcben kann (59). In einer nachfolgenden Studie untersuchten wir insgesamt 36 Zelllinien verschiedener Tumortypen auf ihr Ansprechen auf die Behandlung mit Artesunat allein oder in Kombination mit Ferrosanol\u00ae (60). Dies zeigte, dass Artesunat plus Ferrosanol\u00ae<\/sup> die Zytotoxizit\u00e4t im Vergleich zu Artesunat allein in der Mehrzahl der Zelllinien erh\u00f6ht; 11 Zelllinien zeigten jedoch keine erh\u00f6hte Apoptose und neun Linien zeigten nach der kombinierten medikament\u00f6sen Behandlung eine Abnahme der Apoptose im Vergleich zur Artesunat-Behandlung allein. Es versteht sich, dass Eisen als Co-Faktor f\u00fcr proliferationsbedingte Enzyme fungiert (61).
\n<\/span><\/p>\n
\n
Daher kann Ferrosanol\u00ae<\/sup> die Proliferation dieser neun Zelllinien eher induzieren als unterdr\u00fccken.<\/span> Auf der Basis dieser In-vitro<\/em>-Daten kann nicht zuverl\u00e4ssig empfohlen werden, Eisen als Erg\u00e4nzung zur Behandlung vom Artemisinin-Typ in der tier\u00e4rztlichen oder menschlichen Krebstherapie zuzusetzen. <\/span>Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten, dass der Eisengehalt im Blut nicht mit den \u00dcberlebenszeiten nach der A. annua<\/em>-Therapie assoziiert war, w\u00e4hrend das beim TfR-Gehalt im Tumor der Fall war. Aus praktischen Gr\u00fcnden kann davon ausgegangen werden, dass der normale Eisengehalt des K\u00f6rpers f\u00fcr die Aktivit\u00e4t von Artesunat ausreichend sein sollte. Nur bei Patienten mit Eisenmangel kann eine Eisenerg\u00e4nzung in Betracht gezogen werden. In diesem Fall kann es jedoch wichtig sein, dass Eisen und Artesunat gleichzeitig den Tumor erreichen, damit sich eine m\u00f6gliche verst\u00e4rkende Wirkung der Wirkstoffkombination entwickeln kann. Andernfalls kann Ferrosanol\u00ae<\/sup> schlechtere Wirkungen zeigen und eher zu einer Verst\u00e4rkung als zu einer Unterdr\u00fcckung der proliferativen Tumoraktivit\u00e4t f\u00fchren.
\n<\/span><\/p>\n
Die Wirkung von Eisen wurde auch in anderen fr\u00fcheren Studien gezeigt. Es wurde berichtet, dass die Zugabe von Transferrin die Kreuzresistenz von multiresistenten H69VP-kleinzelligen Lungenkrebszellen gegen Artemisinin hemmen kann (62). Dar\u00fcber hinaus sind Retinoblastomzellen mit hoher TfR-Expression im Vergleich zu normalen Retina-Zellen anf\u00e4lliger f\u00fcr Artesunat. Diese Aktivit\u00e4t ist spezifisch, da ein durch RNA-Interferenz vermittelter TfR-Knockdown die Empfindlichkeit von Retinoblastomzellen gegen\u00fcber Artesunat erh\u00f6ht (63). In \u00dcbereinstimmung mit diesen Befunden erh\u00f6ht die Supplementation mit Holotransferrin die Zytotoxizit\u00e4t von Dihydroartemisinin in T-Zell-Lymphomzellen (64).
\nEs ist gut dokumentiert, dass TfR in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen st\u00e4rker exprimiert wird (61,65-68). Daher wurden experimentelle Therapiestrategien vorgeschlagen, bei denen TfR das Behandlungsziel ist, um gleichzeitig die tumorspezifische Abt\u00f6tung zu verbessern und toxische Nebenwirkungen auf normales Gewebe zu vermeiden, beispielsweise durch antik\u00f6rpervermitteltes Targeting von TfR oder die Erzeugung von TfR – gerichteten Immuntoxine (69-71). Die Erzeugung von Transferrin-Artemisinin-Konjugaten zeigte im Vergleich zu ungekoppeltem Artemisinin eine erh\u00f6hte Zytotoxizit\u00e4t gegen\u00fcber Tumorzellen (72-74).
\n<\/span><\/p>\n
Zuvor f\u00fchrten wir eine klinische Phase I\/II Studie mit Artesunat bei 23 krebskranken Hunden durch, bei der in 1 Fall eine vollst\u00e4ndige Remission und in 7 F\u00e4llen eine stabile Erkrankung nach einer Artesunat-Behandlung festgestellt wurden (39). Die Ergebnisse der vorliegenden retrospektiven Studie mit A. annua<\/em> scheinen verbessert zu sein. In der vorliegenden Studie wurde bei 9 von 25 Hunden (36%) eine Verl\u00e4ngerung der \u00dcberlebenszeit \u00fcber die Schwelle von 18 Monaten festgestellt. Obwohl dieser Trend in zuk\u00fcnftigen Studien best\u00e4tigt werden muss, k\u00f6nnte spekuliert werden, dass die Antikrebswirkung des gesamten Pflanzenextrakts besser ist als die von isoliertem Artemisinin oder dem halbsynthetischen Derivat Artesunat. Tats\u00e4chlich enth\u00e4lt der Pflanzenextrakt neben Artemisinin (75-78) viel mehr zytotoxische Verbindungen, einschlie\u00dflich Arteanuin B, Artemisiten, Scopoletin und 1,8-Cineol. Daher k\u00f6nnen A. annua<\/em>-Pr\u00e4parate allein als Kombinationstherapie verwendet werden. Es k\u00f6nnen mehrere zytotoxische Verbindungen gleichzeitig gegen den Tumor wirken, was zu einer verbesserten Tumorhemmung f\u00fchrt. <\/span><\/p>\n
Es ist bekannt, dass schnell proliferierende Tumoren besser auf eine Standardchemotherapie ansprechen als langsam wachsende Tumoren (79,80). <\/span>Daher umfasste die vorliegende Studie auch Ki-67 als Proliferationsmarker in der immunhistochemischen Analyse. Ki-67 ist eng mit dem Zellzyklus verbunden. Seine Rolle als pr\u00e4diktiver Faktor f\u00fcr den Erfolg der Chemotherapie und als prognostischer Faktor f\u00fcr das \u00dcberleben von Krebspatienten wird diskutiert (81,82). Daher zeigte der signifikante Zusammenhang zwischen der Ki-67-Expression und der Zytotoxizit\u00e4t gegen\u00fcber Artemisinin im Panel von 54 menschlichen Zelllinien aus acht verschiedenen Tumortypen, dass die Ki-67-Expression auch ein prognostischer Marker f\u00fcr die Tumorantwort auf Artemisinin sein k\u00f6nnte. Die vorliegende Studie zeigte eine signifikante Korrelation zwischen der TfR- und Ki-67-Expression in Veterin\u00e4rtumoren und menschlichen Tumorzelllinien, was darauf hinweist, dass die TfR-Expression mit hohen Proliferationsraten verbunden ist und dass Artemisinin bei schnell wachsenden Tumoren aktiver ist als bei langsam wachsenden. Dieses Ergebnis st\u00fctzt fr\u00fchere Daten von menschlichen Tumoren und spricht auch f\u00fcr die Vergleichbarkeit von veterin\u00e4rmedizinischen und menschlichen Tumoren in dieser Hinsicht. Von einer signifikanten Korrelation zwischen TfR und Ki-67-Expression wurde bei Biopsien verschiedener Tumortypen berichtet, darunter Leuk\u00e4mie, Melanom, Brustkarzinom, Hirntumoren, Kopf- und Halskrebs und Speiser\u00f6hrenkrebs (83-88). Obwohl im gesamten Panel von 54 Tumorzelllinien eine signifikante Assoziation zwischen TfR und Ki-67 festgestellt wurde, wurde diese Assoziation in der Mehrzahl der Untergruppen mit unterschiedlichen Tumortypen nicht beobachtet. Dies kann einfach durch die begrenzte Anzahl von Zelllinien pro Tumorentit\u00e4t erkl\u00e4rt werden. Die zuvor ver\u00f6ffentlichten Daten zur signifikanten Korrelation zwischen TfR- und Ki-67-Expression wurden anhand von gr\u00f6\u00dferen Kollektiven von Tumorbiopsien gesammelt (83,89).
\nIn der menschlichen Tumorpathologie ist die H\u00e4matoxylin- und Eosin-F\u00e4rbung auch zum Nachweis von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten n\u00fctzlich ( TILs) (90-92). Daher haben wir in der vorliegenden Studie auch die mit H\u00e4matoxylin und Eosin gef\u00e4rbten Objekttr\u00e4ger der Haustiertumoren auf das Vorhandensein von TILs untersucht, aber TILs konnten im Tumorgewebe nicht nachgewiesen werden. Da die Tumoren im Allgemeinen gro\u00df waren und bereits bei der Diagnose ein fortgeschrittenes Stadium erreicht hatten, wurde angenommen, dass das Immunsystem der Tiere geschw\u00e4cht war und die TIL-vermittelte Immunabwehr gegen den Tumor weitgehend zerst\u00f6rt war.
\n<\/span><\/p>\n
Dar\u00fcber hinaus ist zu erw\u00e4hnen, dass in der vorliegenden Studie keine wesentlichen Nebenwirkungen bei den mit 25 A. annua<\/em> behandelten Hunden und Katzen beobachtet wurden. Im Vergleich zur Tumorbehandlung bei menschlichen Krebspatienten mit dem halbsynthetischen Medikament Artesunat schien A. annua<\/em> noch sicherer zu sein. Unter den 23 mit Artesunat behandelten Hunden mit Krebs wurde bei 16 Hunden Fieber und vor\u00fcbergehende h\u00e4matologische und gastrointestinale Toxizit\u00e4t beobachtet, und 1 Hund starb an einer Lungenentz\u00fcndung (39). Bei menschlichen Krebspatienten wurde die H\u00e4rtefallanwendung von A. annua<\/em> bei 1 Patienten mit Prostatakarzinom in einer fr\u00fcheren Studie gut vertragen (41). Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit Artesunat zu gelegentlichen und vor\u00fcbergehenden Nebenwirkungen f\u00fchrt, einschlie\u00dflich h\u00e4matologischer Toxizit\u00e4t, gastrointestinaler Toxizit\u00e4t, Asthenie und Thrombose bei Dickdarm-, Geb\u00e4rmutterhals- und Brustkarzinomen (42-44). In seltenen F\u00e4llen wurde von Hepatotoxizit\u00e4t mit Artesunat berichtet (93,94). Ob phytotherapeutische Ans\u00e4tze mit A. annua<\/em> sicherer sind als die Behandlung mit Artesunat, muss weiter untersucht werden.
\n<\/span><\/p>\n
Insbesondere berichtete die Mehrheit der Tierhalter, dass sich die Tiere nach der Behandlung mit A. annua<\/em> besser zu f\u00fchlen schienen; Einige waren aktiver, w\u00e4hrend andere entspannter waren. Nat\u00fcrlich sind diese Beobachtungen subjektiv und nicht quantifizierbar, und es ist unklar, ob diese Berichte den psychischen Zustand des Tierbesitzers nach erfolgreicher Behandlung seiner Haustiere widerspiegeln k\u00f6nnen. Diese Beobachtung sollte jedoch nicht vernachl\u00e4ssigt werden, da nicht ausgeschlossen werden kann, dass eine unerwartete und unbeabsichtigte positive Nebenwirkung der A. annua<\/em>-Behandlung vorliegt. In der Tat gibt es einige fr\u00fchere Studien, die diese Beobachtungen st\u00fctzen. Es wurde berichtet, dass die Serotonin-Serumspiegel im Gehirn von mit Artesunat behandelten Kaninchen im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren signifikant h\u00f6her sind (95). Zhu et al (96) berichteten \u00fcber signifikante Remissionen bei nozizeptivem, ver\u00e4ngstigtem und depressivem Verhalten durch Dihydroartemisinin, Artesunat oder Artemether. Amos et al. (97) wiesen auf sedierende Eigenschaften von Artemisinin hin, die durch die Wirkung von Artemisinin auf postsynaptische Dopamin-D2-Rezeptoren im Gehirn vermittelt werden. Dieser neuartige Aspekt der m\u00f6glichen Aktivit\u00e4t von Artemisinin verdient in Zukunft weitere detaillierte Untersuchungen. Die vorliegende Untersuchung wirft auch die allgemeinere Frage nach der Vergleichbarkeit der bei Veterin\u00e4rtumoren erhobenen Daten mit der klinischen Situation bei menschlichen Tumoren und damit der Eignung von Veterin\u00e4rtumoren als Modelle f\u00fcr die Biologie und Behandlung von Krebs beim Menschen auf. Die vorliegende Studie stellte fest, dass die Rolle von TfR und Ki-67 zwischen Veterin\u00e4rtumoren und menschlichen Tumorzelllinien vergleichbar war. TfR und Ki-67 wurden auch mit der Reaktion auf Artemisinin und Artesunat bei Tumoren menschlicher Patienten in Verbindung gebracht (41-43). Obwohl diese Daten bei menschlichen Tumoren noch nicht verifiziert wurden, weisen sie darauf hin, dass veterin\u00e4rmedizinische Tumoren im Rahmen der Artemisinin-Therapie ein geeignetes Modell f\u00fcr klinische menschliche Tumoren darstellen k\u00f6nnen.
\n<\/span><\/p>\n
Unabh\u00e4ngig von dieser Situation gibt es weitere Argumente, die die Eignung von Veterin\u00e4rtumoren f\u00fcr die Untersuchung der menschlichen Krebsbiologie unterst\u00fctzen. Veterin\u00e4rtumoren entwickeln sich spontan, was sie im Vergleich zu anderen Tumoren bei M\u00e4usen und Ratten als bessere Modelle qualifizieren kann. H\u00e4ufig werden Tumore aufrechterhalten, indem syngene Tumoren auf Nagetiere oder humane Xenotransplantat-Tumoren in immunsupprimierte Nacktm\u00e4use transplantiert werden. Eine andere M\u00f6glichkeit besteht darin, die Tumorentwicklung bei M\u00e4usen oder Ratten durch chemische Karzinogene zu induzieren. Obwohl diese Tumormodelle in der pr\u00e4klinischen Onkologie unverzichtbar und von hohem Wert sind, sind sie bis zu einem gewissen Grad k\u00fcnstlich. Hier k\u00f6nnen Tumoren bei Hunden und Katzen vorteilhaft sein, da ihre spontane Entwicklung n\u00e4her an der Situation menschlicher Tumoren liegt. Veterin\u00e4rtumoren haben bisher nicht so viel Aufmerksamkeit erhalten wie die oben genannten Nagetier-Tumormodelle. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um das volle Potenzial von Veterin\u00e4rtumoren als attraktive In-vivo<\/em>-Modelle f\u00fcr die Entwicklung von Strategien zur Behandlung von Tumoren beim Menschen zu untersuchen. <\/span><\/p>\n
Zusammenfassend l\u00e4sst sich sagen, dass bei der aktuellen retrospektiven Studie mit 20 Hunden und Katzen, die mit einer Standardtherapie in Kombination mit A. annua<\/em> behandelt wurden, und 11 Hunden, die nur mit einer Standardtherapie behandelt wurden, eine zus\u00e4tzliche Nahrungserg\u00e4nzung mit A. annua<\/em> bei Veterin\u00e4rkrebspatienten zu einer verbesserten \u00dcberlebensprognose f\u00fchrte. Die Aktivit\u00e4t von A. annua<\/em> h\u00e4ngt m\u00f6glicherweise vom Eisengehalt im Tumor, jedoch nicht im Blut ab, da die TfR-Expression in den Tumoren signifikant mit der \u00dcberlebenszeit und der Artemisinin-Zytotoxizit\u00e4t in einem Kontrollpanel menschlicher Tumorzelllinien korrelierte. Gleiches gilt f\u00fcr den Ki-67-Ausdruck. Tumoren mit hoher Ki-67-Expression, die auf eine hohe proliferative Aktivit\u00e4t hinweisen, waren im Panel menschlicher Zelllinien anf\u00e4lliger f\u00fcr Artemisinin.
\nDie in der vorliegenden Studie pr\u00e4sentierten Daten sollten Hinweise f\u00fcr die Aktivit\u00e4t von A. annua<\/em> gegen Veterin\u00e4rtumoren geben. Prospektive Studien sind erforderlich, um \u00fcberzeugende Beweise f\u00fcr diese Hypothese zu liefern.<\/span><\/p>\n
Danksagung<\/strong>
\nDie Autoren m\u00f6chten Frau Doris Rohr (Abteilung f\u00fcr Pharmazeutische Biologie, Institut f\u00fcr Pharmazie und Biochemie, Universit\u00e4t Johannes Gutenberg, Mainz, Deutschland) f\u00fcr die technische Unterst\u00fctzung bei der F\u00e4rbung der Immunhistochemie danken.<\/p>\n
\n
Finanzierung<\/strong>
\nDiese Studie wurde durch eine intramurale Finanzierung der Johannes Gutenberg-Universit\u00e4t (Mainz, Deutschland) unterst\u00fctzt.<\/span><\/p>\n
Verf\u00fcgbarkeit von Daten und Materialien<\/strong>
\nDie w\u00e4hrend der aktuellen Studie generierten und \/ oder analysierten Datens\u00e4tze sind aufgrund von Einschr\u00e4nkungen der Verf\u00fcgbarkeit dieser Daten nicht \u00f6ffentlich verf\u00fcgbar, aber vom entsprechenden Autor auf begr\u00fcndete Anfrage verf\u00fcgbar.<\/p>\n
Autorenbeitr\u00e4ge
\n<\/strong>Thomas Efferth und Elmar Breuer haben die Studie entworfen. Elmar Breuer behandelte die Tiere, stellte das Material zur Verf\u00fcgung und sammelte die klinischen Daten. MOHAMED E.M. SAEED<\/span> f\u00fchrte die Immunf\u00e4rbung durch. MOHAMED\u2011ELAMIR F. HEGAZY<\/span> f\u00fchrte NMR und HPLC-MS durch. TE f\u00fchrte die statistische Analyse durch, \u00fcberwachte die Arbeit und stellte die Einrichtungen f\u00fcr die Studie bereit. Thomas Efferth und MOHAMED E.M. SAEED haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und die endg\u00fcltige Fassung genehmigt.
\nDie schriftliche Genehmigung f\u00fcr diese retrospektive Studie wurde vom Regierungspr\u00e4sidium Freiburg (Az. 35-9185.81 \/ 1 vom 4. Februar 2019) eingeholt. Die schriftliche Einverst\u00e4ndniserkl\u00e4rung f\u00fcr experimentelle Arbeiten wurde von allen Tierbesitzern eingeholt.<\/p>\n<\/div>\n
<\/div>\n
Einwilligung der Patienten zur Ver\u00f6ffentlichung<\/strong>
\nNicht anwendbar
\n
\nKonkurrierende Interessen<\/strong>
\nEB handelt kommerziell mit LupArte\u00ae.
\nKein Teil der experimentellen Arbeit am Institut f\u00fcr Pharmakologische Biologie (Johannes Gutenberg-Universit\u00e4t Mainz) wurde von EB finanziert.
\nAlle anderen Autoren erkl\u00e4ren, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.<\/p>\n
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INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY DOI: 10.3892\/ijo.2019.4921 Originaldatei Retrospektive Untersuchung von Tumoren kleiner Haustiere, die mit Artemisia annua und Eisen behandelt wurden   MOHAMED E.M. SAEED 1*, ELMAR BREUER 2*, MOHAMED\u2011ELAMIR F. HEGAZY 1 und THOMAS EFFERTH 1 1 Department of Pharmaceutical Biology, Institute of Pharmacy and Biochemistry, Johannes Gutenberg University,…<\/p>\n
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